12月4日，果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室徐娟教授团队在《HorticultureResearch》期刊上在线发表（最终校稿还未提交）了题为“CreSAMT1 is mainly responsible for the biosynthesis of characteristic aroma compound dimethyl anthranilate in Citrus reticulata ‘Chachiensis’”的研究论文，首次阐明了NMM在柑橘中的生物合成途径，确定了CreSAMT1和CreSAMT2基因的功能，并揭示了转录因子在NMM生物合成调控中的作用。这些发现为柑橘风味育种和GCP品质提升提供了重要的理论基础，并为推动柑橘香料产业的发展提供了新的思路。
柑橘属植物(Citrus reticulata Blanco)因其鲜果和果汁的消费价值以及果皮的药用特性而备受重视。由柑橘属果皮干燥制成的陈皮(Citri reticulatae pericarpium，CRP)已被广泛用作传统中药达数百年之久。CRP的原料主要来自柑橘属果皮，不同品种的柑橘果皮制作的CRP品质和功效存在差异。茶枝柑（C. reticulata‘Chachiensis’，CZG）是制作广陈皮（GCP）的主要原料，与陈皮（CP）相比，GCP被认为具有更高的药用价值。GCP的独特香气被认为是其品质的重要指标。其中，二甲基邻氨基苯甲酸甲酯（dimethyl anthranilate，NMM）是CZG中特有的挥发性酯类化合物，也是GCP特征香气的重要成分。NMM具有“辛辣”和“草本”的香气，在CZG的陈化过程中转化为“草本”香气，在GCP中得以保留。基于已表征的基因，已经实现了NMM的微生物工程生产。然而，柑橘中NMM的生物合成途径尚未阐明。
GC-MS分析共检测到67种挥发性化合物，包括49种萜类化合物、15种脂肪酸衍生物和3种苯丙烷/苯化合物。在所有64个柑橘品种中，d-柠檬烯是最丰富的挥发性化合物。NMM被认为是CZG及其对应产品GCP的重要生物标志物。所有CZG样品中的NMM平均含量为118.34±19.75 μg·g-1，而在其他柑橘品种中均未检测到。此外，根据已发表的数据，108份柑橘种质，包括橙子、柚子、柠檬和宜昌橙，在其成熟果皮中均未积累NMM，这进一步证明了CZG的独特性。PCA和OPLS-DA分析也证实了CZG与其他柑橘品种在挥发性成分上的显著差异。
不同柑橘品种中挥发性成分的可视化
为了进一步研究参与NMM生物合成的基因，研究团队分析了茶枝柑(CZG)和沙糖橘(STJ)在不同发育阶段的挥发性成分。共检测到47种挥发性化合物，其中CZG中有43种，STJ中有36种。包括NMM在内的7种挥发性化合物已被证实是陈化广陈皮中的重要香气活性物质，这些化合物在新鲜的CZG果皮中均被检测到。结果显示，随着果实发育，STJ中NMM的含量逐渐下降，并在成熟期消失，而CZG中NMM的含量在整个发育过程中始终保持较高水平。
NMM含量及其相关生物合成基因的变化
茴香酸(AA) 是莽草酸途径中的中间体，其羧基和氨基可以被甲基化，分别形成N-甲基-2-氨基苯甲酸 (NMA) 和甲基苯甲酸 (MA)，两者都是NMM的潜在前体。为了鉴定参与NMM生物合成的候选基因，研究团队使用RNA-seq技术对CZG和STJ在不同发育阶段的果皮以及花朵进行了全基因组转录组分析，并筛选出10个候选的CreSAMTs基因。SAMTs是甲基化小分子酸的关键酶，尤其是在甲基水杨酸生物合成中。
与CZG中NMM生物合成相关的SABATH基因家族
筛选了含有PF03492基序的基因模型，该基序对应于典型植物SAMTs的Methyltransf_7结构域。在C. reticulata ‘Mangshan’基因组中，共鉴定出49个潜在的CreSAMT基因。通过相关性分析和WGCNA分析，确定了CreSAMT1和Cre2g 027310.1基因与NMM的积累密切相关。由于NMM的生物合成之前未被表征，因此分析了候选基因的生化性质和底物特异性。研究团队通过体外酶学实验证实，CreSAMT1和CreSAMT2都能够催化NMA和AA的甲基化，分别生成NMM和MA。CreSAMT1对AA的亲和力和催化效率最高，而CreSAMT2对BA、SA和NMA的亲和力和催化效率更高。瞬时RNAi和OE实验进一步证实，CreSAMT1在NMM的生物合成中起关键作用。
‘Chachiensis’中CreSAMTs的功能特征
为了进一步阐明CZG中NMM积累的调控机制，研究团队进行了共表达网络分析。通过共表达网络分析，研究人员发现143个转录因子与CreSAMT1的表达显著相关。在这些与CreSAMT1显著相关的转录因子中，有13个AP2、5个C2H2、15个MYB和2个TCP，这些是研究团队关注的重点。同时，双荧光素酶报告基因测定表明，CreERF35和CreZAT11被证实能够促进CreSAMT1的表达。
与NMM生物合成相关的潜在转录因子 (TFs) 分析
研究首次阐明了NMM在柑橘中的生物合成途径，确定了CreSAMT1和CreSAMT2基因的功能，并揭示了转录因子在NMM生物合成调控中的作用。这些发现为柑橘风味育种和GCP品质提升提供了重要的理论基础，并为推动柑橘香料产业的发展提供了新的思路。
论文链接：https://doi.org/10.1093/hr/uhaf331
本文转自：公众号：创新生物（Hortic Res | 华中农业大学徐娟团队揭示柑橘中特征香气化合物二甲基邻氨基苯甲酸甲酯的生物合成）
