2025年7月22日，Plant Biotechnology Journal在线发表了华中农业大学欧阳波教授团队的最新研究进展：“Establishment of an efficient Agrobacterium-mediatedtransformation system for chilli pepper and its applicationin genome editing”。该研究通过优化基因型、筛选报告基因、改良转化流程等一系列组合拳，成功攻克了辣椒转化的难题，建立了一套可实际应用的农杆菌介导转化体系，并验证了其在CRISPR/Cas9基因编辑中的应用潜力。

面对辣椒转化这一“顽疾”，研究团队没有局限于单一环节的改良，而是进行了一场系统性的优化探索。

研究首先证实，基因型是影响农杆菌易感性和植株再生能力的关键因素。他们最初尝试对矮化品种'MiniPep'进行转化，但收效甚微。为此，团队建立了一套筛选标准——以病毒诱导的基因沉默（VIGS）效率作为农杆菌易感性的指标，以植株侧枝再生能力作为再生潜力的指标，从而成功筛选出更具转化潜力的基因型PC69。

2.选择最佳“指示剂”：RUBY报告基因脱颖而出

为了直观、高效地追踪和筛选转化事件，研究者比较了DsRed、eGFP和RUBY三种报告基因的效果（图1a）。结果表明：

图1a

• DsRed：在转化的愈伤组织中未观察到明显的红色荧光。

• eGFP：虽然能在愈伤组织中检测到绿色荧光，但在再生芽中却难以观察，表明转化细胞可能再生困难或荧光信号被组织掩盖（图1b）。

• RUBY：作为一种可见的报告基因，其产生的甜菜红素赋予了转化组织从愈伤、幼苗、叶片、根系到花、果实全生育期的粉红色表型，无需特殊设备即可肉眼识别，表现远优于前两者，是辣椒转化的理想报告基因（图1c, 1e）。

图1b，c，e

3.优化转化流程：真空处理与非预培养    

在确定了合适的基因型和报告基因后，团队进一步优化了转化流程。结果表明，对于子叶外植体，采用真空渗透处理并取消预培养步骤的组合，能够显著提高转化效率（定义为产生RUBY表型愈伤的外植体比例）（图1d）。

图1d

通过上述一系列的系统性优化，研究团队最终建立了一套完整、高效的辣椒遗传转化流程（图1f），其有效转化效率（产生带RUBY表型再生芽的外植体/总外植体）可达约5%，达到了可供实际应用的水平。通过对T1代后代的观察，RUBY表型呈现出符合孟德尔定律的3:1分离比，证明了外源基因的稳定遗传（图1e）。

图1f

为了验证该体系的最终应用价值，研究者利用它转化了一个靶向辣椒内源基因CaPDS的CRISPR/Cas9基因编辑载体（图1a）。在转化后代中，他们成功观察到了由CaPDS基因功能缺失导致的白化表型的再生芽（图1g）。并且通过对白化植株靶点区域的Sanger测序，证实了在PAM序列上游发生了预期的碱基缺失（图1g）。

图1g

这一结果有力地证明，该新建立的转化体系不仅能够稳定表达外源基因，同样能够作为高效的递送平台，将CRISPR/Cas9系统导入辣椒细胞并实现有效的基因编辑。

此外，该研究还初步探索了进一步提升转化效率的可能性。他们发现，过表达番茄的生长调控因子SlGIF1，能够进一步提高辣椒的转化效率，这表明引入关键发育调控因子是未来持续优化该体系的重要方向。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70216

本文转自公众号：可研Plus（https://mp.weixin.qq.com/s/bLARlz9BTT-H3DwlWQxPJQ）