2025年6月16日，华中农业大学果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室郑日如副教授团队在园艺学领域国际著名学术期刊Horticulture Research上在线发表了题为“OfWRKY33 binds to the promoter of key linalool synthase gene OfTPS7 to stimulte linalool synthesis in Osmanthus fragrans flowers”的研究论文，解析了桂花（Osmanthus fragrans）中芳樟醇生物合成的分子机制，通过对20个栽培品种中芳樟醇含量最高的‘Boyeyingui’（BBYG）进行基因组和转录组测序，鉴定出萜烯合成酶基因OfTPS7为关键芳樟醇合成基因，其表达水平与芳樟醇含量呈显著正相关（相关系数0.82），体外酶活和体内瞬转实验证实OfTPS7能催化香叶基二磷酸（GPP）生成芳樟醇。进一步通过酵母单杂交和加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选到核定位的转录因子OfWRKY33，其可直接结合OfTPS7启动子的W-box元件，通过双荧光素酶报告基因（LUC）和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证了这种结合能激活OfTPS7转录，且OfWRKY33过表达可协同诱导MEP途径基因OfDXS1等的表达，从而促进芳樟醇的生物合成。该研究首次构建了OfTPS7-OfWRKY33-MEP 通路的调控网络，为桂花香气代谢工程提供了关键靶点。

摘要

挥发性香气化合物对人类感知花朵具有重要贡献。桂花是著名的芳香植物，而芳樟醇被证实是主要的香气活性化合物。尽管一些萜烯合成酶（TPS）已被鉴定，但其核心代谢基因及其转录调控的全面研究仍有待揭示。在此，我们从20个广泛栽培的品种中选择了芳樟醇含量最高的特定品种波叶银桂（BBYG）进行基因组和转录组测序。在25个新的推定OfTPS中，仅OfTPS6和OfTPS7能在植物体内专一性产生芳樟醇。生化分析表明，OfTPS6和OfTPS7在体外能够将香叶基二磷酸（GPP）催化为芳樟醇和少量其他单萜。时空相关性分析进一步证实，OfTPS7的表达水平与20个品种中的芳樟醇含量强烈相关，表明OfTPS7是必需的芳樟醇合成酶基因。结合酵母单杂交筛选和加权相关网络分析（WGCNA），鉴定出一个核定位的转录因子OfWRKY33作为潜在调控因子。Y1H、LUC和EMSA实验证明，OfWRKY33直接结合OfTPS7启动子的W-box以刺激其转录。OfWRKY33可协同诱导OfTPS7和1-脱氧-D-木酮糖1（OfDXS1）的表达，从而促进芳樟醇的形成。该结果首次鉴定了关键芳樟醇合成酶基因OfTPS7和一个在桂花花朵芳樟醇生物合成复杂调控网络中起作用的新型转录因子。

论文设计思维导图

研究背景

香气化合物对植物的发育及其与环境的相互作用至关重要[1]。它们也对消费者感知花朵做出了巨大贡献。源自植物的香气化合物被广泛提取并应用于广泛的工业领域[2-4]。然而，由于复杂的生物化学合成过程和调控机制，改善园艺植物的香气性状始终是一项相当大的挑战。

桂花是一种著名的芳香植物，在中国已有超过2500年的历史[5]。在大多数栽培品种中，约70%的总香气化合物为萜类化合物，其通过质体定位的2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径合成[6-10]。芳樟醇是不同桂花品种花朵中的重要香气活性化合物，为鲜花及其精油赋予独特的花香[4,11,12]。萜烯合成酶（TPS）是将香叶基二磷酸（GPP）直接转化为芳樟醇和其他单萜的关键酶[13-16]。先前的研究通过与拟南芥直系同源物的同源比对，鉴定了候选芳樟醇合成酶基因OfTPS1/2/5，并通过体内和体外实验对其功能进行了表征[17-20]。然而，全基因组分析结合群体重测序数据显示，桂花品种间OfTPS基因家族存在显著的等位基因多样性[17-21]。这种种间变异凸显了对整个OfTPS基因库进行系统功能表征和时空表达谱分析的必要性。此类综合分析不仅将阐明芳樟醇生物合成的分子机制，还将确定负责大多数桂花品种中单萜生成的主要OfTPS，从而推动芳香植物育种中靶向代谢工程策略的发展。尽管植物基因组中拥有相当数量的TPS，但仅有有限比例的TPS能够产生萜类化合物[22,23]。例如，在小苍兰（Freesia × hybrida）中，FhTPS1负责芳樟醇的形成，而FhTPS4、FhTPS6和FhTPS7是同时产生单萜/倍半萜的双功能基因[13]。为全面理解植物中萜类化合物的生物合成，进行基因组测序以及体内外功能鉴定至关重要[23,24]。

近期研究表明，MYB、AP2/ERF、bHLH、MADS和WRKY等转录因子通过直接与关键通路基因的启动子相互作用，在萜类生物合成中发挥调控作用[25-30]。FhMYB21L2通过与FhTPS1启动子上的MYBCORE位点互作，介导芳樟醇的合成[25]。OfMYB21可结合OfTPS2的启动子，正向影响芳樟醇的合成[20]。在桂花中，OfMYB1R114通过与OfCCD4启动子互作并上调其表达，促进β-紫罗兰酮香气化合物的生成[31]。WRKY转录因子通过结合W-box顺式作用元件，在植物发育和生长调控中广泛发挥作用[29,30]。近期研究显示，WRKY也参与次级代谢物的合成与调控。例如，CrWRKY42通过增加多个类胡萝卜素生物合成基因的表达，促进类胡萝卜素的积累[30]。在桂花基因组中，筛选出154个具有WRKY结构域的OfWRKY基因，其中8个呈现花特异性表达模式[32]。然而，它们在桂花花朵香气化合物中的潜在功能及其转录调控机制仍不明确。

本研究旨在确定主要的芳樟醇合成酶基因并揭示其调控网络。为实现这一目标，我们首先选择了在20个测试品种中芳樟醇水平最高的‘BBYG’（波叶银桂）品种进行基因组和转录组分析。通过对所有OfTPS家族成员的功能表征和表达谱分析，OfTPS7成为控制芳樟醇合成的关键基因。不同于传统的基于同源性的单基因分析，我们对OfTPS同源物的全基因组评估不仅解决了功能注释中长期存在的不确定性，还证实了OfTPS7在不同品种芳樟醇生物合成中的保守作用。接下来，我们以OfTPS7作为酵母单杂交（Y1H）筛选探针，并结合转录组数据的加权基因共表达网络分析（WGCNA），鉴定出OfWRKY33作为核心转录激活因子。该调控因子直接靶向OfTPS7启动子中的W-box基序，激活其表达，同时协调调控多个MEP途径基因以增强芳樟醇合成。引人注目的是，OfWRKY33在所有20个品种中的表达谱与芳樟醇积累密切相关，进一步证实了其在香气生物合成中的进化保守性。

超越早期局限于单个基因或单一品种的零散研究，我们的研究结果建立了一个整合的TPS-WRKY-MEP调控轴。这一框架不仅破译了芳樟醇合成的分子基础，还为育种者提供了精确的遗传靶点，用于在桂花中设计改良优良的芳香性状。

内容解析

1、芳樟醇是桂花花朵中关键的特征性香气化合物

采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术，对20个广泛栽培的桂花品种盛开花朵中的挥发性香气化合物进行了检测（图1A）。检测到的成分包括萜类化合物、苯丙素类、脂肪酸衍生物及其他香气化合物。其中，萜类化合物在所有品种中均占主导地位（图1B）。由于芳樟醇及其氧化物的含量高且气味活性值（OAVs）显著（补充数据表格S1、补充数据图S1），它们成为主要的香气活性成分，赋予桂花花朵明显的花香。鉴于‘BYYG’品种在20个栽培品种中芳樟醇含量最高（图1C），我们选择其用于芳樟醇生物合成的深入研究。在‘BYYG’中，芳樟醇及其氧化物分别占萜类化合物的48%和7.4%（图1D）。此外，时序分析表明，芳樟醇及其氧化物的含量从花蕾期开始增加，在盛花期达到最大值（图1E）。因此，本研究选择‘BYYG’品种进行基因组和转录组分析，旨在阐明桂花中复杂的芳樟醇生物合成机制。

图1 桂花花朵中的挥发性香气化合物

A 20个广泛栽培桂花品种的盛开花朵；1：橙红丹桂，2：状元红，3：香山丹桂，4：朱砂桂，5：红雁凝香，6：娇容，7：柳叶银桂，8：黄川金桂，9：莲子丹桂，10：福建红，11：金秋早，12：贵州四季桂，13：软叶金桂，14：紫月，15：碎银，16：福鼎珠，17：大叶黄，18：丹妆，19：米节银桂，20：波叶银桂。B 20个品种中不同挥发性香气化合物含量的热图；比例尺=1厘米。C 20个品种盛花期花朵的芳樟醇含量。D BBYG盛开花朵中不同萜类化合物的比例。E BBYG四个开花阶段的芳樟醇含量，F1：花蕾期；F2：初花期；F3：盛花期；F4：末花期。所有实验均重复三次，每次包含三个生物学重复。误差线表示平均值±标准差，星号表示与对照组相比的显著性差异分析，采用单因素方差分析评估。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.001

2、萜烯合成酶基因家族的鉴定

为了开展对桂花OfTPS基因家族的研究，我们对芳樟醇含量最高的‘BYYG’品种花朵进行了四个开花阶段的基因组测序和转录组测序（图1E和图2A、B）。研究采用多种测序技术组装桂花参考基因组，分别生成了264.92 Gb的HiFi高质量数据和49.86 Gb的SMRT高质量数据。基于K-mer的统计显示，基因组大小为711.42 Mb，具有1.23%的高杂合度。组装的基因组大小达726 Mb，contig N50为18.83 Mb（补充数据表格S2），显著超过了‘柳叶银桂’（OFL，contig N50 = 2.36 Mb）[33]和‘日香桂’（OFR，contig N50 = 1.60 Mb）[21]的基因组。利用Hi-C测序技术，我们将98.21%的序列定位到23条染色体上（图2A和B）。由于高质量的组装，BUSCO评估显示基因组完整性达98.20%，预测基因涵盖了真双子叶植物谱系中97.50%的进化保守核心蛋白，超过了其他两个桂花基因组的对应值（分别为94.50%和96.80%）。ISO-seq reads的高映射率和提升的BUSCO得分表明组装基因组具有优异的完整性和准确性。综上，评估显示桂花‘BYYG’基因组（OFB）在组装和注释质量上均更优（表1）。基于该基因组，我们还对四个开花阶段的花朵进行了转录组测序。建库、Illumina测序和组装后，四个样本分别生成了约3181万、3080万、3355万和3335万条总清洁reads（补充数据表S3），上述数据表明转录组数据符合后续分析要求。

由于缺乏基因组序列，此前仅通过NCBI blast筛选并鉴定出3个OfTPS作为芳樟醇合成酶基因。在本研究中，共注释了27个OfTPS，其中包括通过隐马尔可夫模型（HMM）扫描和BLASTp搜索鉴定的25个新候选基因，这些基因尚未进行功能表征。OfTPS1和OfTPS3此前已被阐明并功能鉴定为芳樟醇合成酶基因[17]。研究扩增了25个编码推定蛋白的全长基因，其氨基酸长度为260至683个，并根据染色体位置将其命名为OfTPS6-30（补充数据表S4）。大多数OfTPS在染色体I、II、V、VI和XIX上成簇分布，表明这些染色体发生了多次复制和新功能化事件（补充数据图S2和S3）。通过系统发育分析，OfTPS被分为三个亚组：TPS-a（13个）、TPS-b（7个）和TPS-g（5个）（图2C）。氨基酸序列比对显示，属于TPS-g亚家族的OfTPS1/6/7/12/13/20典型性缺乏负责环化反应的RRX8W结构域（补充数据图S4）。其他所有OfTPS均包含RRX8W、DDXXD和NSE/DTE等保守元件，这些元件在结合Mg2+<或Mn2+辅因子中起基础作用。我们对‘BYYG’的基因组分析和其他品种的重测序显示，OfTPS的编码序列（CDS）在不同品种间结构保守（补充数据表S5-S6）。这种保守性表明，OfTPS的结构变异（如突变、插入缺失）不太可能解释观察到的芳樟醇含量差异。相反，我们提出OfTPS的差异表达水平和/或特定TPS同工型之间的功能协同作用是关键驱动因素。

为了将MEP通路基因的表达与花期挥发性芳樟醇的积累相关联，基于转录组测序分析了四个开花阶段推定基因的FPKM值，其中37个候选基因涉及MEP和甲羟戊酸（MVA）通路。MEP通路中候选基因的表达水平显著高于MVA通路中的基因，这与桂花花朵中较高的单萜类化合物浓度一致（补充数据图S5和表S7）。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测所有OfTPS的时空表达模式，结果显示6个OfTPS（OfTPS1/3/6/7/9/29）在花中的表达量显著高于其他组织（图2D）。值得注意的是，OfTPS7的转录水平从芽期到盛花期显著升高，随后下降，这与挥发性芳樟醇的释放模式一致（图2D）。

图2 ‘BBYG’的基因组测序及OfTPS序列分析

A ‘BBYG’的基因组特征图，a：染色体编号；b：基因密度；c：长散布重复序列（LINE）；d：长末端重复序列（LTR）；e：DNA转座子；f：染色体共线性。B ‘BBYG’基因组的Hi-C互作图谱。C 利用MEGA7软件通过最大似然法对桂花及其他植物的TPS进行系统发育分析。D 通过RT-qPCR检测OfTPS在根、茎、幼叶等不同组织及不同开花阶段（F1-F4）的表达热图。

3、OfTPS6和OfTPS7的过表达可在体外和体内增加芳樟醇的合成量

为了验证OfTPS的功能，研究人员克隆了全部25个新的OfTPS（OfTPS6-OfTPS30），并将其瞬时转化到烟草叶片和桂花花朵中，以确定它们是否具备合成芳樟醇的能力。在烟草叶片中，仅有OfTPS6和OfTPS7能够合成芳樟醇（图3A），而其他基因未产生任何产物（补充数据图S6）。为验证OfTPS6和OfTPS7的酶学功能，分别以牻牛儿基二磷酸（GPP）和法尼基二磷酸（FPP）为底物进行了底物特异性分析。OfTPS6和OfTPS7的重组蛋白在大肠杆菌中表达并纯化得到可溶性蛋白。体外酶促反应表明，OfTPS6和OfTPS7属于多功能酶，可催化生成多种产物。值得注意的是，OfTPS6主要将GPP转化为芳樟醇及少量副产物，如β-月桂烯、D-柠檬烯、α-蒎烯和顺式-β-罗勒烯（图3B）；OfTPS7可将GPP催化生成芳樟醇，同时产生少量β-月桂烯和D-柠檬烯（图3B）。当以FPP为前体进行孵育时，OfTPS6和OfTPS7均无法产生任何挥发性芳香化合物（补充数据图S7）。此外，亚细胞定位分析显示，OfTPS7定位于合成单萜的质体中，而OfTPS6则定位于细胞质（补充数据图S8）。这些结果明确证实了OfTPS6和OfTPS7在体外和体内均具有芳樟醇生物合成功能。

在花朵中瞬时过表达OfTPS6导致其转录水平较空载体对照约增加3.43倍，挥发性芳樟醇及其氧化物含量增加5.35倍（图3C-D，补充数据图S9）。此外，花朵中瞬时过表达OfTPS7使其转录水平约增加3.10倍，挥发性芳樟醇及其氧化物含量较空载体对照升高7.7倍（图3C-D，补充数据图S9）。相反，OfTPS6和OfTPS7瞬时沉默组中检测到的芳樟醇及其氧化物浓度显著低于对照组（图3E-F）。

图3 OfTPS6和OfTPS7的体内及体外功能验证。

A 对照组、OfTPS6和OfTPS7过表达组烟草叶片的芳香化合物分析。B OfTPS6和OfTPS7的胞外酶功能（以GPP为底物），1：β-月桂烯；2：D-柠檬烯；3：α-蒎烯；4：β-罗勒烯；5：芳樟醇。C 实时荧光定量PCR检测OfTPS6和OfTPS7在桂花中的表达，对照组：花朵注射空载体，OE组：花朵分别注射OfTPS6和OfTPS7过表达载体。D 对照组、OfTPS6过表达组和OfTPS7过表达组桂花花朵中的芳樟醇含量。E 对照组和沉默组桂花花朵中OfTPS6和OfTPS7的表达水平。F 对照组、OfTPS6沉默组和OfTPS7沉默组桂花花朵中的芳樟醇含量。所有实验重复三次，每次包含三个生物学重复。误差线表示平均值±标准差，星号表示与对照组相比的显著性差异分析，采用单因素方差分析评估。*P<0.05，**P<0.01*，***P<0.001。

4、OfTPS7在不同品种的芳樟醇生物合成中起着关键作用

芳樟醇通过MEP途径合成，萜烯合成酶（TPS）在此过程中发挥关键作用。不同品种间芳樟醇含量的差异是一个复杂现象，可能受遗传和环境等多种因素影响。我们的重测序分析显示，OfTPS基因的编码序列（CDS）在20个品种中相对保守，且所有蛋白序列均包含保守的TPS结构域，如DDXXD和NSE/DTE基序，这些结构域对萜烯合成酶的活性至关重要（补充数据表S7和S8）。为探究桂花中关键的芳樟醇合成酶基因，我们检测了20个品种中所有芳樟醇合成酶基因OfTPS1/2/5/6/7的转录水平及芳樟醇含量。结果表明，OfTPS2仅在‘BBYG’和‘MJYG’两个品种中表达；OfTPS1、OfTPS5和OfTPS6在多数品种中表达，但其与芳樟醇含量的相关系数均小于0.5。仅OfTPS7在所有20个品种中均有表达，且其与芳樟醇含量的共表达系数最高，达0.82（图4A-D，补充数据表S7和S8）。此外，在‘Boyeyingui’中，OfTPS1、OfTPS2和OfTPS7的表达水平与芳樟醇含量的关联分析显示，TPS7的相关系数最高，达到0.94（补充数据表S9）。空间分析还表明，OfTPS7在花朵初开和盛花阶段表达量较高，与芳樟醇的释放模式一致（图4D-E）。因此，我们得出结论：OfTPS7在桂花芳樟醇的生物合成中发挥基础性作用。

图4 20个品种中芳樟醇合成酶基因表达与芳樟醇及其氧化物含量的相关性分析。

A-D 不同品种中OfTPS1、OfTPS5、OfTPS6、OfTPS7表达水平与芳樟醇含量的燕尾图分析。E 花中高表达芳樟醇合成酶基因的表达水平与芳樟醇含量的相关性分析。误差线表示平均值±标准差，星号表示与对照组相比的显著性差异分析，采用单因素方差分析评估。

5、酵母单杂交（Y1H）实验结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）有助于筛选潜在转录因子OfWRKY33

在确定了编码参与芳樟醇合成的酶的关键基因后，我们随后的研究重点转向了解OfTPS7的调控机制。为了鉴定潜在的调控因子，我们以OfTPS7启动子作为诱饵进行了酵母单杂交（Y1H）筛选，目标是桂花花卉组织构建的cDNA文库。筛选出了6个潜在候选因子，包括WRKY、ERF、MADS、ZAT和MYB家族成员，其中一个明确归类为WRKY家族的转录因子（图5A-C，补充数据表S10）。为了探索与芳樟醇生物合成相关的关键基因，我们对四个关键发育阶段的桂花花朵进行了转录组测序，旨在鉴定潜在的调控因子。差异表达基因（DEGs）通过log2倍数变化（FC）±1和校正P值<0.01的标准确定。过滤后，共有19,199个非冗余DEGs保留用于加权基因共表达网络分析（WGCNA），分别得到与芳樟醇和其他萜类相关的四个富集模块。模块与性状的相关性分析表明，包含1,890个基因的蓝色模块与芳樟醇合成具有强关联性（r=0.66，P=0.02）（图5D）。此外，对蓝色模块中的1,890个基因应用更严格的阈值（|log2倍数变化|≥1.5），将范围缩小到1,159个表达变化显著的基因（补充数据图S10A和B）。维恩图分析鉴定出26个在所有发育阶段均持续差异表达的高可信度候选基因。其中，6个转录因子（TFs）与OfTPS7的相关系数高于0.85，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果进一步证实，4个TFs的表达模式与OfTPS7基本平行（补充数据图S10C）。时空分析显示，OfWRKY33不仅在花中的转录水平高于茎、幼叶和根，而且其表达趋势与花中芳樟醇的释放模式相似（图6A）。进一步分析20个品种中OfWRKY33的表达谱发现，其与芳樟醇含量（r=0.96，p<0.001）和OfTPS7表达水平（r=0.90，p<0.001）均呈显著正相关（图6E）。同时，酵母单杂交（Y1H）实验也显示OfWRKY33与OfTPS7之间存在潜在相互作用（图5C）。这些数据表明，OfWRKY33可能与芳樟醇的生物合成相关。

图5 结合酵母单杂交（Y1H）与加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选OfTPS7潜在调控因子。

A OfTPS7启动子顺式作用元件分析；B 酵母单杂交筛选文库中阳性菌的检测；C 酵母单杂交筛选文库阳性菌的功能注释；D ‘BBYG’不同开花阶段转录组的WGCNA分析。

6、OfWRKY33是一种定位于细胞核的转录因子

OfWRKY33（GenBank登录号PP598872；桂花基因组ID Ofr17654）的完整cDNA序列为1,468 bp，编码一个489个氨基酸的蛋白质，其C端区域附近含有保守的WRKYGQK结构域（图6B）。OfWRKY33与拟南芥AtWRKY33（GenBank NP_181381.2）的氨基酸序列具有50%的相似性（图6C）。WRKY33的预测分子量为53.796 kDa。系统发育分析显示，OfWRKY33被归为WRKY-I亚家族（补充数据表S11）。为研究其亚细胞定位，将CaMV35S:OfWRKY33-YFP融合构建体和CaMV35S:YFP对照构建体分别导入本氏烟草叶片。荧光显微镜分析表明，OfWRKY33-YFP特异性定位于细胞核，与mCherry共定位，而CaMV35S:YFP则均匀分布于整个细胞中（图6D）。

图6 OfWRKY33的表达谱、序列特征及亚细胞定位分析。

A OfWRKY33与拟南芥AtWRKYs的部分序列比对，显示保守结构域；B 分析桂花与其他物种WRKY蛋白的进化关系，利用MEGAX软件通过最大似然法构建系统发育树（TPS蛋白信息见补充数据表S5）；C OfWRKY33的亚细胞定位，YFP荧光指示各融合蛋白的位置（黄色显示），细胞核位置由核定位标记确定（红色显示）；D OfWRKY33在‘BBYG’不同组织部位和开花阶段的表达模式；E OfWRKY33在20个品种中的表达水平。“合并”列显示所有通道的荧光信号组合。标尺=100微米。所有实验均重复三次，每次包含三个生物学重复。误差线表示平均值±标准差，星号表示与对照组相比的显著性差异分析，采用单因素方差分析评估（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

7、OfWRKY33可提高转基因花中芳樟醇含量，并调控某些MEP通路基因的表达

为进一步研究OfWRKY33在MEP通路中的作用，我们在桂花花朵中开展了瞬时转基因实验。将分别携带质粒PK7WG2D-OfWRKY33和病毒诱导基因沉默（VIGS）质粒pTRV2-OfWRKY33载体的农杆菌GV3101菌株，通过真空渗透法导入初花期的桂花花朵。过表达组花朵中OfWRKY33和OfTPS7的表达量显著升高，导致芳樟醇及其氧化物含量显著增加（图7A-B，补充数据图S11）。实验同时监测了MEP通路基因的转录水平，值得注意的是，在‘BBYG’不同开花阶段转录组中具有较高FPKM值的OfDXS1、OfDXR2和OfIDI2基因，在OfTPS7过表达花朵中也受到显著诱导（图7B和E，补充数据图S5）。而其他芳樟醇相关基因如OfDXS5、OfGPPS1和OfGPPS5在PK7WG2D-OfWRKY33过表达花朵中未呈现类似表达模式。与对照组相比，OfWRKY33沉默组花朵中相关基因表达量（尤其是OfDXS1、OfGPPS1和OfGPPS5）和芳樟醇含量均显著降低（分别为7.41倍和5.85倍）（图7C-D和补充数据图S11）。这些结果表明，OfWRKY33是芳樟醇生物合成的正调控因子。

图7 OfWRKY33在桂花花朵中的功能验证

A OfWRKY33过表达株系中OfWRKY33和OfTPS7的基因表达水平；B OfWRKY33过表达株系的芳樟醇含量；C OfWRKY33沉默株系中OfWRKY33和OfTPS7的基因表达水平；D OfWRKY33沉默株系的芳樟醇含量；E OfWRKY33过表达组与对照组中MEP通路基因的表达；F OfWRKY33沉默组与对照组中MEP通路基因的表达。所有实验均重复三次，每次包含三个生物学重复。误差线表示平均值±标准差，星号表示与对照组相比的显著性差异分析，采用单因素方差分析评估（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

8、OfWRKY33直接与OfTPS7的启动子相互作用并诱导其转录

为了评估OfWRKY33激活OfTPS7表达的能力，我们进行了荧光素酶（LUC）报告基因检测。将OfTPS7启动子连接至LUC报告载体，同时将OfWRKY33的编码序列插入效应载体（图8A）。与空载体相比，OfWRKY33在OfTPS7启动子调控下显著提高了LUC/LEN比值（图8B）。此外，LUC成像检测进一步证实OfWRKY33在体内可诱导OfTPS7启动子活性：在共表达区域（OfWRKY33 + OfTPS7pro-Luc）观察到强荧光信号，而对照组区域（空载体 + OfTPS7pro-Luc）仅显示微弱荧光信号（图8C）。酵母单杂交（Y1H）实验也表明OfWRKY33与OfTPS7启动子存在显著相互作用（图8D）。我们还通过Y1H实验检测了OfWRKY33与OfDXS1、OfDXR2和OfIDI2启动子的关系，但未观察到直接相互作用（补充数据图S12和S13）。

为了探究OfWRKY33蛋白的DNA结合特异性，我们以OfTPS7启动子区域为靶序列开展了电泳迁移率变动分析（EMSA）。实验成功诱导并纯化了用于该分析的OfWRKY33蛋白（补充数据图S14）。EMSA结果显示，当重组蛋白OfWRKY33-His与标记探针混合时，出现了特异性的迁移条带。值得注意的是，随着未标记野生型竞争探针浓度的增加，这种His标签蛋白-DNA复合物条带逐渐减弱，表现出浓度依赖性竞争效应。相反，加入未标记的突变探针未能竞争结合，迁移条带得以保留。这些观察结果最终证实了OfWRKY33在体外对OfTPS7启动子中W-box基序的结合特异性。

图8 OfWRKY33直接结合于OfTPS7启动子序列中的W-box基序

A 双荧光素酶载体示意图，效应载体OfWRKY33构建于CaMV35S驱动的pGreen-62-SK载体上，报告载体OfTPS7启动子构建于pGreen II-0800 LUC载体以驱动荧光素酶（LUC）表达。B 烟草瞬时荧光活性检测显示OfWRKY33具有转录激活活性，可促进OfTPS7的表达。C OfWRKY33转录活性的相对荧光强度分析。D 酵母单杂交实验显示OfWRKY33与OfTPS7启动子的相互作用。E OfWRKY33直接结合OfTPS7启动子的EMSA分析，Mut代表突变探针，突变位点以黑色虚线框标注；“+”和“-”表示添加或未添加探针/蛋白；50×表示50倍未标记冷探针，100×表示100倍未标记冷探针，1×表示1倍未标记突变探针，2×表示2倍未标记突变探针，箭头指示蛋白-DNA复合物或游离探针的位置。所有实验重复三次，每次包含三个生物学重复。误差线表示平均值±标准差，星号表示与对照组相比的显著性差异分析，采用学生t检验评估。* P<0.05

讨论与结论

萜类化合物是各类花卉中丰富的芳香化合物，而芳樟醇及其氧化物被确定为多种植物中关键的芳香活性物质[34,35,36]。尽管在阐明不同物种中芳樟醇的生物合成途径方面已取得显著进展，但核心芳樟醇合成酶基因及其潜在的转录调控机制仍未被充分了解。在此，我们阐明了OfTPS7在多个品种芳樟醇合成中的主导作用，并解析了桂花花朵中由OfWRKY33驱动的芳樟醇生物合成新调控网络。我们证实，OfWRKY33通过直接结合OfTPS7启动子并增强OfTPS7及其他关键通路基因的表达，对芳樟醇的形成发挥正向调控作用（图9）。

图9 桂花花朵中芳樟醇的生物合成及其转录调控模式图

牻牛儿基焦磷酸（GPP）作为前体供体，OfTPS1/2/5/7定位于质体且在20个品种中表达，而OfTPS6定位于细胞质并在2个品种中表达。其中，OfTPS7是关键的芳樟醇合成酶基因，OfWRKY33可直接与OfTPS7启动子中的W-box基序互作，从而调控芳樟醇的形成。

综上所述，不同于依赖与已知物种进行同源性比较的传统单基因研究方法，本研究对基因组中所有OfTPS同源基因进行了全面评估。通过转基因验证和表达分析，我们证实OfTPS7是负责芳樟醇合成的关键基因。既往研究常低估OfTPS基因的多样性，而本研究通过确立OfTPS7在不同品种芳樟醇合成中的核心作用，阐明了其功能不确定性。此外，我们构建了OfTPS7的转录调控模型：OfWRKY33可直接结合OfTPS7启动子中的W-box基序，并上调MEP通路相关基因的表达。本研究突破了既往单一品种或单基因的研究局限，揭示了TPS-WRKY-MEP协同调控网络。OfWRKY33作为主效转录调控因子的发现，为代谢工程提供了策略基础，有助于精准调控桂花香气物质的生物合成。

原文转自：公众号植物代谢调控（[精读]Hort.Res. ||华中农大郑日如团队：揭示OfWRKY33调控桂花花朵中芳樟醇生物合成的分子机制）